豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒ELISA法

               豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒ELISA法
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
豬免疫球蛋白M ELISA試劑盒敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷試劑盒。且擁有試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等特點(diǎn)。ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。ELISA常用方法：雙抗體夾心法測(cè)定。規(guī)格：96T/48T
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%。保存條件及有效期：試劑盒保存：2-8℃，有效期：6個(gè)月。
測(cè)定時(shí)一般需經(jīng)過(guò)以下步驟：固相包被→加待測(cè)樣品→溫育→洗滌+加酶標(biāo)物→溫育→洗滌→加底物→溫育一加終止液→比色→判定結(jié)果。ELISA操作較繁雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。在操作中應(yīng)注意以下5個(gè)方面。
1．隨著病情的進(jìn)展或由其他因素影響，某些抗體在機(jī)體內(nèi)的含量發(fā)生大幅波動(dòng)，因此有必要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，例如對(duì)血清標(biāo)本作適當(dāng)稀釋，或離心分離血脂等。間接法測(cè)定中，標(biāo)本適當(dāng)稀釋還可降低非特異性反應(yīng)。
2．加樣一般使用加液器，在ELISA中一般有4次加樣：加標(biāo)本、加酶結(jié)合物、加底物和加終止液。加標(biāo)本時(shí)必須每份標(biāo)本使用一支移液器吸嘴，以免交叉污染。加酶結(jié)合物、底物和終止液時(shí)則不需更換吸嘴。
3．在成批手工檢測(cè)中，還應(yīng)注意操作時(shí)差的影響。加樣及混勻時(shí)間的差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法及定量檢測(cè)影響很大，不注意可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果或定量不準(zhǔn)。
4．洗滌是ELISA操作過(guò)程中決定實(shí)驗(yàn)成敗的一個(gè)關(guān)鍵步驟。目的是除去未結(jié)合的免疫反應(yīng)物，終止抗原抗體反應(yīng)，除去標(biāo)本中與反應(yīng)無(wú)關(guān)的成分、游離的酶標(biāo)物以及反應(yīng)過(guò)程中吸附于固相載體上的非特異性物質(zhì)。可用洗板機(jī)洗板或手工洗板，前者洗滌質(zhì)量較好，各反應(yīng)孔洗滌效果均一，批內(nèi)、批間差異小，手工洗板應(yīng)注意控制各孔洗滌效果，差異不宜太大。
5．準(zhǔn)確判定結(jié)果須使用ELISA測(cè)讀儀（酶標(biāo)儀），比色法判讀可選擇單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)，根據(jù)反應(yīng)液顏色的不同選用不同波長(zhǎng)的濾光片，以空白孔校零測(cè)定反應(yīng)孔的吸光度值（A值）。酶標(biāo)儀具有良好的重復(fù)性。
ELISA試劑組成
1．抗原 在ELISA中應(yīng)用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有3類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。
2．抗體 在ELISA中應(yīng)用的抗體可分為多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）。多抗取白免疫動(dòng)物的抗血清，制備較簡(jiǎn)單，但抗血清成分復(fù)雜，除含針對(duì)抗原（多個(gè)表位）的抗體外，還含有多種其他抗體，親和力和特異性相對(duì)要低于單抗，且制備周期長(zhǎng)，批間差異較大。
3．酶和底物 在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP
（1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。（2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應(yīng)在l 000U／mg以上。
4．固相載體 固相載體是ELISA中用以分離結(jié)合標(biāo)記物和游離標(biāo)記物的主要手段，應(yīng)與各種免疫活性物質(zhì)有良好的結(jié)合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。
5．包被 將免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合于固相載體上的過(guò)程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等；常用的方法有吸附法、化學(xué)交聯(lián)法及親和素-生物素間接包被法。