瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞

目的

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞是一種方便的方式過度和兩個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞外（分泌或膜）蛋白。293是人類腎上皮細(xì)胞，腺病毒轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)品。293 T是導(dǎo)數(shù)也表達(dá)SV4 0大T抗原，使游離復(fù)制質(zhì)粒含有SV4 0的起源和早期啟動子區(qū)域。他們（兩個(gè)）有不尋常的財(cái)產(chǎn)被高度transfectable由以下磷酸鈣（磷酸）2transfection協(xié)議。高達(dá)50%的效率是可以實(shí)現(xiàn)的。

材料

•*培養(yǎng)液（高血糖）：補(bǔ)充瓦特/ 10%總線（無論是瓦特/或瓦特/熱滅活在55°℃/分鐘），非必需氨基酸，na-pyruvate，和谷氨酰胺（筆/ streptmycin：可選）

•轉(zhuǎn)染試劑：

我）200 CaCl 2：2米水，過濾消毒，儲存在4攝氏°

二）x2hbs：8.0克氯化鈉，氯化鉀0.37g，201mg（是的！毫克）2HPO 4•無水，用葡萄糖，5克/毫升培養(yǎng)基（調(diào)整PH值7.05氫氧化鈉和過濾消毒，儲存在4攝氏°）

•脫氧核糖核酸試劑盒提取成績好。溶液中電子兼容。基本上，沒有必要將脫氧核糖核酸。

程序

培養(yǎng)條件

增長將很快。通常倍增時(shí)間< 1天的觀察。分裂細(xì)胞4天，每3 ~ 10至1 : 20稀釋和文化下5%的二氧化碳。細(xì)胞松散連接，所以你可以分離細(xì)胞與ED TA單獨(dú)但短暫的胰蛋白酶消化為單懸。不overtreat胰蛋白酶。

轉(zhuǎn)染293細(xì)胞

以下的協(xié)議是10厘米的菜（中：10毫升）。如果你使用6孔或12孔板，總體積的介質(zhì)應(yīng)3毫升和一點(diǎn)五毫升，分別，和數(shù)額減少每個(gè)試劑因此。

1。細(xì)胞的前一天晚上給60 - 70 %融合在一天的轉(zhuǎn)染。如果達(dá)到100%的效率也會降低總匯。小于50%融合可能確定但數(shù)額蛋白表達(dá)會很低，因?yàn)樯倭?/span>的細(xì)胞。

2。一小時(shí)前的轉(zhuǎn)染，改中含有25µ米氯喹（從中國股票在公共電視網(wǎng)，儲存在- 20攝氏°）。量應(yīng)該是10毫升每碟。（氯喹可以省略，但效率提高約10）

3。添加10µ克基因ddh2o（1095µ我總）在15毫升無菌試管，然后添加155µ我200氯化鈣。當(dāng)你準(zhǔn)備好后，加入1250µ升2xhbs滴輕輕攪拌。添加此混合物直接向細(xì)胞滴通過介質(zhì)。做在1 - 2分鐘后加入2xhbs。你會發(fā)現(xiàn)中變成橙色。確保你均勻?yàn)?/span>滴在整個(gè)地區(qū)。

4。培養(yǎng)7 - 11小時(shí)很細(xì)，可見粉塵狀沉淀。孵化后，沖洗一次，變化中又無氯喹，10 ml /碟。

5。收獲細(xì)胞，或培養(yǎng)上清液中，轉(zhuǎn)染后48至72小時(shí)。分泌蛋白，可以改變你的媒體（3天或4，節(jié)省收集增刊）并給它一個(gè)3 - 4天的文化。只要細(xì)胞還活著，他們生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。然而，當(dāng)時(shí)的分泌水平達(dá)到zui大值之間的差異蛋白質(zhì)。